OBRAZOWANIE WIELOPARAMETROWE
Analiza wielu białek w pojedynczych komórkach
Jak badany czynnik wpływa na poziom i lokalizację wybranych białek?
Iteracyjna immunofluorescencja pozwala zmierzyć wiele białek w tej samej próbce, zachowując kontekst komórkowy. Analiza pojedynczych komórek ujawnia rozkład odpowiedzi, który może być niewidoczny w średniej dla całej populacji.
DANE EKSPERYMENTALNE
Ilustracja przedstawia pomiar jednego białka, pSTAT1. Nie jest panelem wielomarkerowym ani prezentacją pełnego procesu pomiaru wielu białek.
Przebieg badania
Barwienie i obrazowanie
Znakujemy wybrane białka przeciwciałami i rejestrujemy obrazy fluorescencyjne. Wyodrębniamy komórki oraz ich przedziały, np. jądra.
Kolejne rundy pomiaru
W metodzie 4i przeciwciała są eluowane między rundami obrazowania. W CycIF fluorofory są inaktywowane przed kolejnymi rundami barwienia i obrazowania.
Łączenie wyników
Dopasowujemy pomiary z kolejnych rund, tworząc profile białkowe poszczególnych komórek. Porównujemy intensywności sygnałów markerów i rozkłady odpowiedzi między warunkami.
Co mierzymy
Intensywności sygnałów białkowych w pojedynczych komórkach i określonych przedziałach komórkowych. Dla paneli wielomarkerowych także macierze pomiarów na poziomie komórki i profile zmian w szlakach sygnałowych.
Interpretacja
Fluorescencja jest pomiarem względnym, zależnym od swoistości przeciwciała, barwienia i warunków obrazowania. Zmiana jednego markera nie wystarcza do ustalenia pełnego mechanizmu działania.
Projekt badania
Zestaw przeciwciał, przygotowanie próbki i liczba rund obrazowania zależą od zgodności markerów i celu badania. Każdy panel wymaga odpowiednich kontroli i walidacji testu.