Możliwości badawcze

Badamy aktywność związków wobec celów molekularnych oraz ich wpływ na komórki. Wykonujemy testy biochemiczne, badania komórkowe i wieloparametrowe analizy mikroskopowe. Metody dobieramy do pytania badawczego.

01 / BADANIA BIOCHEMICZNE

Aktywność związku wobec celu molekularnego

W testach biochemicznych sprawdzamy, jak związek wpływa na aktywność wybranego celu molekularnego. Weryfikujemy przewidywania modeli obliczeniowych, porównujemy siłę działania związków i wybieramy kandydatów do badań komórkowych.

Przesiewowe badania aktywności związkówCzy związek hamuje aktywność badanego celu w warunkach testu?

Stosowane metody: Badanie przy jednym stężeniu związku, z użyciem enzymu, jego substratu i odpowiednich kontroli. W badaniach kinaz stosujemy ADP-Glo do pomiaru ADP powstającego w reakcji enzymatycznej.
Co otrzymasz: Aktywność względem kontroli i lista związków do badań zależności odpowiedzi od stężenia.

Zależność działania od stężeniaJak stopień hamowania zmienia się wraz ze stężeniem związku?

Stosowane metody: Serie stężeń dla związków aktywnych w badaniu przesiewowym, z inhibitorami referencyjnymi i kontrolami na tej samej płytce.
Co otrzymasz: Krzywe zależności odpowiedzi od stężenia oraz oszacowania IC50, o ile pozwalają na to dane. Podajemy warunki testu; wyniki te nie są pomiarem powinowactwa wiązania.

Badania potwierdzające aktywnośćCzy wynik badania przesiewowego potwierdza się w kolejnych pomiarach?

Stosowane metody: Badania zależności odpowiedzi od stężenia, z kontrolami testu i inhibitorami referencyjnymi. W razie potrzeby planujemy dodatkowe sprawdzenie, czy związek zakłóca metodę detekcji.
Co otrzymasz: Ocena aktywności związku uwzględniająca wyniki kontroli i ograniczenia istotne dla interpretacji.

Dobór testu do celu molekularnegoKtóry test pozwoli odpowiedzieć na pytanie dotyczące Twojego celu?

Stosowane metody: Przed uzgodnieniem badania oceniamy dostępność białka docelowego i odczynników, dobieramy substrat, metodę detekcji i kontrole. Nowy cel wymaga oceny wykonalności i sprawdzenia przydatności testu.
Co otrzymasz: Uzgodniony zakres badania, mierzony parametr, kontrole i kryteria dalszych prac.

02 / BADANIA NA PŁYTKACH WIELODOŁKOWYCH

Żywotność i funkcjonowanie komórek

Badamy wpływ związków na żywotność i funkcjonowanie komórek oraz oceniamy ich cytotoksyczność. Pomiary prowadzimy na płytkach 96- i 384-dołkowych. Stosujemy związki referencyjne i ustalone kryteria kontroli jakości.

Ilustracja czytnika mikropłytek, płytki wielodołkowej i pożywki do hodowli komórkowej. — Pomiary fluorescencyjne, luminescencyjne i kolorymetryczne na płytkach wielodołkowych.

Żywotność komórekWpływ związku na żywotność komórek względem kontroli.

Stosowane metody: CellTiter-Glo, CellTiter-Fluor, RealTime-Glo MT, Calcein-AM i XTT.
Pomiar: Pomiar luminescencyjny, fluorescencyjny lub kolorymetryczny w czytniku mikropłytek.

CytotoksycznośćUszkodzenie błon komórkowych i udział martwych komórek.

Stosowane metody: CellTox i testy uwalniania LDH.
Pomiar: Pomiar luminescencyjny, fluorescencyjny lub kolorymetryczny w czytniku mikropłytek.

Śmierć komórek i apoptozaWskaźniki apoptozy, nekrozy i autofagii.

Stosowane metody: RealTime-Glo Annexin V, CaspGLOW, DeadEnd TUNEL i CYTO-ID.
Pomiar: Pomiary luminescencji i fluorescencji w czytniku mikropłytek.

Potencjał błony mitochondrialnejStan mitochondriów jako wczesny wskaźnik cytotoksyczności.

Stosowane metody: TMRM, rodamina 123 i MitoTracker.
Pomiar: Pomiar fluorescencji w czytniku mikropłytek.

Funkcje mitochondriówZależność komórek od glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej.

Stosowane metody: Porównanie pożywek z glukozą i galaktozą oraz oznaczanie ATP.
Pomiar: Pomiar luminescencji w czytniku mikropłytek.

Stres oksydacyjny i reaktywne formy tlenuPoziom reaktywnych form tlenu (ROS) i równowaga antyoksydacyjna.

Stosowane metody: MitoSOX, H2DCF-DA, ROS-Glo i GSH/GSSG-Glo.
Pomiar: Pomiary fluorescencji i luminescencji w czytniku mikropłytek.

Przenikanie związków przez błonyOcena transportu związku w modelach stosowanych do badania wchłaniania i bariery krew–mózg.

Stosowane metody: PAMPA oraz dwukierunkowe testy transportu w modelach Caco-2 / MDCK.
Pomiar: Pomiary absorbancji lub LC-MS w testach bezkomórkowych i komórkowych.

Migracja i inwazjaRuch, adhezja i inwazja komórek pod wpływem związku.

Stosowane metody: Testy zamykania obszaru wolnego od komórek (Oris Pro) oraz komory Transwell / Boydena.
Pomiar: Pomiary w jasnym polu i fluorescencji w hodowlach 2D, również w czasie rzeczywistym.

03 / MIKROSKOPIA WIELOPARAMETROWA

Odpowiedź pojedynczych komórek i mechanizmy działania

Analizujemy wiele cech pojedynczych komórek, w tym ich morfologię, żywotność i wybrane markery szlaków sygnałowych. Rozróżniamy populacje komórek i porównujemy ich reakcję na badane związki. Pozwala to wykryć różnice, które mogą pozostać niewidoczne w pomiarze całej populacji.

Przykładowy system mikroskopii wieloparametrowej. — Mikroskopia wieloparametrowa. Przykładowy system obrazowania.

Liczenie komórekŻywotność i selektywność działania w hodowlach jednorodnych i mieszanych.

Stosowane metody: Barwniki jądrowe (DAPI / Hoechst), kalceina / PI, fluorescencja, jasne pole i cyfrowy kontrast fazowy.
Co otrzymasz: Liczebność poszczególnych populacji, krzywe żywotności w funkcji stężenia oraz wartości IC50 / EC50.

Liczenie komórek: metoda i wyniki

Cykl komórkowy i proliferacjaDziałanie antyproliferacyjne i blokada mitozy.

Stosowane metody: Zawartość DNA (DAPI / PI / Hoechst), EdU / BrdU, pHH3, Ki67 i PCNA.
Co otrzymasz: Rozkład faz cyklu, udziały komórek w G1 / S / G2 / M oraz indeks mitotyczny.

Cykl komórkowy: metoda i wyniki

Analiza wielu białek w pojedynczych komórkachZmiany w szlakach sygnałowych i analiza mechanizmu działania z użyciem wielu markerów.

Stosowane metody: Iteracyjna immunofluorescencja 4i / CycIF z przeciwciałami rozpoznającymi wybrane białka i markery organelli.
Co otrzymasz: Macierze pomiarów 15–40 lub więcej markerów w pojedynczych komórkach oraz mapy cieplne obrazujące zmiany w szlakach sygnałowych.

Pomiary białek: metoda i wyniki

Poziomy transkryptówEkspresja RNA w pojedynczych komórkach.

Stosowane metody: RNA-FISH na poziomie pojedynczych cząsteczek, opcjonalnie w połączeniu z wielomarkerową immunofluorescencją.
Co otrzymasz: Przestrzenne mapy ekspresji i liczba transkryptów w komórce.

Analiza zmian morfologii komórekWzorce fenotypowe związane z mechanizmem działania, efektami poza głównym celem molekularnym i genotoksycznością.

Stosowane metody: Cell Painting oraz barwienia jądra, siateczki śródplazmatycznej, mitochondriów, aparatu Golgiego, aktyny i RNA.
Co otrzymasz: Profile fenotypowe, przestrzenne mapy ekspresji i pomiary na poziomie pojedynczych komórek.

Mikroskopia żywych komórekJak szybko pojawia się efekt i jak zmienia się w czasie.

Stosowane metody: Kaspazy 3/7, potencjał błony mitochondrialnej, ROS i wapń (Fluo-4); fluorescencja, jasne pole i cyfrowy kontrast fazowy.
Co otrzymasz: Krzywe kinetyczne, czas do wystąpienia określonego zdarzenia i pole pod krzywą.

Mechanizmy działania i transport wewnątrzkomórkowyInternalizacja, transport do lizosomów, translokacja czynników transkrypcyjnych i aktywacja receptorów GPCR.

Stosowane metody: Barwniki wrażliwe na pH, np. pHrodo, markery EEA1 / Rab7 / LAMP1, porównanie sygnału jądrowego i cytoplazmatycznego oraz FRET.
Co otrzymasz: Wskaźnik internalizacji, kolokalizacja, sygnał FRET i szybkość translokacji do jądra.

Modele 3DDziałanie i przenikanie związków w sferoidach i organoidach.

Stosowane metody: Barwienie żywych i martwych komórek oraz serie obrazów konfokalnych z różnych głębokości próbki.
Co otrzymasz: Zasięg śmierci komórek od powierzchni do wnętrza modelu oraz pomiary objętościowe.

Te same metody mikroskopowe wykorzystujemy również w rozwijanych badaniach ex vivo na materiale od pacjentów.

Badania ex vivo

POROZMAWIAJMY O BADANIACH

Zaplanujmy badanie eksperymentalne.

Opowiedz nam o związku, modelu i pytaniu badawczym. Przed rozpoczęciem badania potwierdzamy jego wykonalność i uzgadniamy metody, kontrole oraz dane i opracowania, które otrzymasz.

contact@inventro.co